背景资料

     Exosomes,中文名外泌体，因其形态而得名，直径为30-150nm，是细胞外泌囊泡中体积较小的一种。是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构。尽管外泌体最初在1983年就被发现，但人们一直认为它只是一种细胞的废弃物。然而最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。

    研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。此外外泌体具有脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此是一种很好靶向给药系统（targeteddelivery system）。

Meilunbio外泌体提取试剂盒

Meilunbio exosome isolation kit

（for Cell Culture Media）

产品货号：MA0402  50ML [¥2800.00]

http://www.meilune.com/goods.php?id=22932

简介

外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150纳米)，由不同类型的细胞在培养过程中分泌，在体液(包括血液、唾液、尿液和母乳)中大量存在。外泌体被认为是细胞间的信使，在特定的细胞之间传递效应物或信号分子。然而，外泌体的形成和组成以及它们所涉及的生物学途径仍不完全清楚。

外泌体功能和转运等生物学研究需要分离完整的外泌体，美仑外泌体提取试剂盒（细胞培养基上清）（Meilunbioexosomeisolation kit (for Cell Culture Media)）是专门用于分离提取细胞培养基上清样本中外泌体的试剂。本产品提供了一种简单可靠的方法从细胞培养基上清样本中浓缩完整的外泌体：通过捆绑水分子，迫使较难溶解的组分(即外泌体)离开溶液，经过简单的较低速度离心即可从样本中分离出大量外泌体。本产品与传统的超高速离心相比，样本中的外泌体所受到的压力较小，可以保持较完整的形态；同时提取过程所需要的时间更短、所需要的样本起始量更低、提取效率更高。使用本产品获得的外泌体可适用于多种下游实验，如RNA分析、高通量测序、细胞共培养等。

本试剂盒足够分离提取100mL细胞培养基上清中的外泌体。

图1.Hela细胞培养基上清外泌体NTA测试与进口品牌对比。(A)粒径分布图；(B)外泌体样本电影图片。以上数据显示美仑与进口品牌提取的外泌体NTA结果非常接近。仪器型号: ZetaView PMX 110 (Particle Metrix, Meerbusch,Germany)。

图2. Hela细胞培养基上清外泌体RNA和蛋白检测与进口品牌对比。(A)外泌体总RNA浓度鉴定；(B)外泌体总蛋白CD63western blot 检测（anti-CD63一抗购自abcam(ab134045）。以上数据提示美仑外泌体提取总量要高于进口品牌。

详情

样本准备：

1. 收集细胞培养基。

2. 将细胞培养基以3000×g离心20分钟，去除细胞和碎片。

3. 小心将步骤2得到的细胞培养基上清液转移到新的试管中。

外泌体分离：

1. 将所需体积的无细胞培养基转移到新试管中，并添加0.5体积的外泌体提取试剂。（可以参考下表）

2. 将培养基和外泌体提取试剂混合物进行涡旋或上下颠倒混合，直到得到均匀的溶液。

3. 4℃孵育过夜。

4. 孵育后，于2 ~ 8℃，10000×g离心1小时。

5. 吸出并丢弃上清液，外泌体则包含在管底的沉淀中(有些时候肉眼较难分辨)。

6. 使用1X PBS或适当缓冲液重悬外泌体，参考下表。

7. 外泌体沉淀被重悬以后就可以通过亲和法进行下游分析或进一步纯化。

8. 将分离得到的外泌体保存在2℃至8℃，最长保存1周，或≤-20℃长期保存。

注意事项：

1. 本品适用于各种类型细胞培养液上清中外泌体的提取。为防止FBS中较多的牛外泌体造成污染，可在细胞培养至50%-70%左右更换无血清培养基或者不含外泌体的血清培养基，继续培养约12~48h后收集上清使用。也可直接使用不含外泌体的血清培养基直接培养细胞，后续直接收集细胞培养液上清进行外泌体提取。

2. 一次实验需要多少体积细胞培养液取决于上清中外泌体的量，可能受细胞类型、状态、数目的影响各不相同，根据实验需求决定样本起始量。

3. 用固定角度的离心机离心时，需标记管子的摆放方向。一般样本中外泌体含量较少，离心后可能肉眼观察不到沉淀，标记方向后，在重悬时将1×PBS朝离心管靠外侧的内壁反复吹打洗脱即可。

4. 离心后的沉淀可用100-200 μL的1×PBS重悬后使用，也可使用下一步实验的试剂直接处理沉淀。例如，可直接使用裂解液吹打重悬沉淀后进入RNA、蛋白质提取流程。 

保存条件：

4ºC保存，一年有效。

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关于外泌体应用领域小贴士

1肿瘤早期发现体外诊断，精准医疗

液态活检已经被评为2015年度十大突破性技术之一，并且在2015年12月的《NSCLC血液EGFR基因突变检测中国专家共识》中规范了中国EGFR的血液检测，以期能够推动肺癌的精准治疗，这无疑显示出了这项技术的巨大进步以及在临床应用中的巨大潜力。

液态活检按照检测的对象分类，可以分为核酸水平的ctDNA检测和细胞水平的循环肿瘤细胞（CTC）检测以及外泌体（Exosome）检测。随着液态活检技术的广泛应用，人们已经对CTC和ctDNA有了较为深入的了解，也开发出很多基于CTC和ctDNA检测技术的平台，但是对作为液态活检“三驾马车”之一的外泌体（Exosome）却研究的很少，一直以来科学界对其均没有给予足够的重视，所以关于其作用机制的研究也不够深入和透彻。不过随着美国科学家詹姆斯·罗斯曼、兰迪·谢克曼和德国科学家托马斯·苏德霍夫因为在发现细胞囊泡运输系统及其运行调节机制研究中的杰出贡献而荣获诺贝尔医学奖，这种外泌体（Exosome）被忽视的情况正在发生改变，很多研究机构和课题小组开始重视对外泌体（Exosome）的研究，相关文献不断被报道出来，增进了人们对外泌体（Exosome）的认知。

外泌体（Exosome）一词最早出现在1981年，但是直到2007年发现外泌体（Exosome）可以作为细胞间基因交流的机制时，才重新激发了人们对外泌体（Exosome）研究的兴趣。随着科学研究的不断深入，目前已经发现外泌体（Exosome）是由通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多泡内涵体，多泡内涵体再与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30~120nm的膜性囊泡。外泌体（Exosome）内含物的很大部分是蛋白质，如：CD9、CD63、CD81、MHC-I等；肿瘤细胞产生的外泌体（Exosome）中还可以检测到过度表达的特异性的蛋白标志物，如TRAIL和TGF-β等。除已经发现的蛋白质外，外泌体（Exosome）中还含有大量的mRNA、miRNA、cirRNA和DNA片段等成分，由于这些内容物的存在提供了丰富的生物信息，可以多方位、多角度的揭示出疾病信息，这就蕴藏了巨大潜力。而且，外泌体（Exosome）来源广泛，淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等都可以分泌外泌体，被分泌出的外泌体（Exosome）还会进入羊水，腹水，唾液，血液，乳汁，尿液中，这就极大地拓展了检测途径，使临床检测变为可能。

外泌体（Exosome）最初被认为是毫无作用的“垃圾”，但随着研究的不断深入，人们发现事实并非如此，外泌体（Exosome）是具有功能活性并可进行细胞间信息传递的微囊泡，其可以介入机体免疫、新陈代谢以及肿瘤生长和产生耐药性各个方面。

目前国内在液态活检领域主要集中在CTC和ctDNA，外泌体（Exosome）还鲜有涉及，而美国企业具有一定的技术优势，目前已经开发的可用于外泌体分析的技术有：超速离心法（最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒）、密度梯度离心法（通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集）、超滤离心（利用不同截留相对分子质量的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体）、磁珠免疫法（外泌体表面有其特异性标记物，用包被相应抗体的磁珠与外泌体共同孵育后，即可将外泌体吸附并分离出来）、PEG-base沉淀法（聚乙二醇可与疏水性分子结合共沉淀，被用来沉淀外泌体）、新一代测序分析（从癌症患者的体液中分离出外泌体，对其中的DNA、RNA进行全基因组、外显子组和转录组测序分析，筛查肿瘤细胞来源的基因突变情况）。

肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体（Exosome）释放到周围环境中去，同时，外泌体（Exosome）能在4℃保存96h，或是在-70℃下保存更长时间，可以从患者的体液中分离外泌体（Exosome）用于早期临床诊断。随着技术的进步，已经有生物公司尝试涉足外泌体领域，如Codiak BioSciences公司（检测胰腺癌癌细胞外泌体中所包含的一种蛋白Glypican-1，这种蛋白有可能作为一种非侵入性诊断和筛查处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌）；Exosome Diagnostics公司推出全球首个基于外泌体（Exosome）RNA的液态活检产品：ExoDx Lung（ALK）（是一种基于血浆外泌体（Exosome）的诊断产品，可准确检测非小细胞肺癌患者的EML4-ALK突变）。还有外泌体（Exosome）中存在黑色素瘤标志物包括MIA、S100B和酪氨酸酶相关蛋白2，且黑色素瘤患者胞外体中MIA和S100B浓度显着高于健康人群和非黑色素瘤患者，通过检测MIA和S100B表达水平对黑色素瘤的诊治具有积极地参照作用。

所有真核细胞类型包括造血细胞、上皮细胞、神经细胞、干细胞、脂肪细胞和癌症细胞均可在培养条件下分泌外泌体。体内所有体液，包括血液、唾液、脑脊液、腹水，甚至尿液中都可以分离得到外泌体。这些外泌体传输多种信号分子，包括蛋白质、信使核糖核酸（mRNA）和非编码核糖核酸（RNA），其携带的分子可以被其他细胞吸收。因此，外泌体可以将生物信息转移到相邻细胞。这种细胞间通信不仅涉及生理功能，还涉及一些疾病的发病机理，包括肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病等。

目前，在各种健康与疾病模型中都发现，外泌体通过分子信息传递扮演着重要的角色。外泌体还越来越多地被认为是疾病的生物标志物和预后因子，具有重要的临床诊断和治疗意义。除此之外，它们还有潜力被用于临床，作为基因和药物递送的载体。

疾病早期诊断和预后。健康人和多种疾病的患者会将含有不同RNA和蛋白质成分的外泌体释放到体液循环中，因其特殊性，外泌体可以作为生物标志物来对疾病进行检测。例如，从血液或尿液中分离的外泌体可以用作癌症、中枢神经系统疾病、心脏病的诊断和预后的指标。

目前，肿瘤的早期诊断受限于发现时间太晚以及诊断过程的烦琐、费用昂贵。因此，在人体体液内寻找和检测肿瘤细胞分泌的外泌体可能会是一种新颖的、无创的、高度可靠的诊断方式。例如，有研究报道，通过对患者血液中的外泌体进行分析，肺癌和胰腺癌的早期诊断率分别已经能够达到75%和90%。肿瘤细胞来源的外泌体特异性蛋白质或小分子RNA（miRNA）标志物可以作为肿瘤诊断检测的高特异性指标，并且用于指示肿瘤的发展情况和侵袭程度。

2016年1月，全球首个基于外泌体的癌症诊断产品在美国上市。由Exosome Diagnostics公司推出的这一液体活检产品标志着新兴的外泌体生物学向成熟迈进了一步。其他致力于外泌体诊断或治疗应用的公司还包括Codiak BioSciences公司、Exosome Sciences公司、ExovitaBiosciences公司、CliniCanHealth Research公司、CARISLIFE SCIENCES公司和ExoCoBio公司等。虽然关于外泌体生物学的基本问题仍有很多悬而未决，但高通量诊断方面的应用开发已在不断向前推进。

除了肿瘤，外泌体在其他疾病如心血管疾病等的诊断和治疗的相关临床试验也在世界范围内开展中。

2外泌体新型治疗剂

肿瘤转移是一个包括癌细胞侵入、血管中存活、宿主器官附着和殖民化等多步骤的复杂过程。外泌体能够影响这个级联反应的每一步，因此可作为肿瘤治疗的靶点。肿瘤细胞在转移到其他组织时需要在间质细胞间移动并到达血管中，在这个过程中，肿瘤细胞外泌体通过纤维连接蛋白促进肿瘤细胞的运动性，再通过蛋白酶促进细胞外基质的分解、血管生成，进而促进肿瘤转移。

多数肿瘤细胞对转移的组织具有指向性，而外泌体表面的整合素就是决定其指向性的因子，如外泌体αvβ5整合素决定了对肝脏的指向性，而外泌体α6β4?α6β1整合素决定了对肺部的指向性。

此外，恶性肿瘤细胞往往能够通过分泌大量外泌体抑制宿主固有免疫。对外泌体的质谱研究发现，恶性肿瘤细胞的外泌体含有大量活化型的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR），可以抑制宿主细胞α型干扰素(IFN-α)的产生。这就解释了为什么部分肿瘤患者固有免疫低下，也为晚期癌症患者的治疗提供一个新的策略和理论依据。

3外泌体在心脏修复中同样起着关键作用。

外泌体通过内含的miRNA直接调控基因表达，将信息传递给靶细胞。尽管干细胞移植治疗是一种很有前景的修复损伤心脏组织并使其再生的辅助手段，但由于缺血心脏中移植细胞的存活状况不佳，一般仅能观察到心脏功能的轻度改善。最近的研究表明，干细胞释放的外泌体可以作为心脏修复潜在的无细胞治疗剂。

干细胞分泌的外泌体相比干细胞有如下优点：（1）旁分泌效应，外泌体作为干细胞旁分泌作用的一种媒介；（2）组合起效，外泌体可与现有的组合物或方法进行组合；（3）个性化，外泌体可改造特定活性成分；（4）靶向特异性，外泌体被工程化改造后，具有靶向特定细胞类型或组织的功能；（5）安全性高，外泌体治疗属于无细胞疗法。

事实上，动物实验表明：在小鼠急性心肌梗塞术后，注射来源于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、心脏祖细胞（cardiacprogenitor cells，CPCs）、胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）或心肌源性细胞（Cardiosphere-derivedcells，CDCs）的外泌体均可改善心脏功能，减轻心脏纤维化，刺激血管生成。例如，心源性细胞外泌体（CDCexo）能通过特异性的巨噬细胞极化为急性心肌梗死提供心脏保护作用。

心脏再灌注后，CDCexo的输注降低了大鼠和猪心肌梗死模型的梗死面积，而且CDCexo会减少梗死组织内CD68+巨噬细胞数量，并改变巨噬细胞的极化状态。自体CD34+干细胞的移植可以改善缺血组织再灌注后的功能，并降低严重肢体缺血患者的截肢率。其作用机制在于：CD34+干细胞分泌的外泌体（CD34Exo）促进小鼠下肢缺血模型血管生成。

虽然临床前研究的证据表明干细胞释放的外泌体可以作为心肌修复的潜在无细胞治疗剂，但是，目前将外泌体完全用作心脏修复治疗剂之前还是有很多核心问题需要解决。

4外泌体作为药物治疗的递送系统

外泌体本身的惰性相当高，但它们与细胞膜融合可将所携带的物质和信号传递到受体细胞并改变其生物学功能，因此，外泌体是纳米药物递送或基因治疗的潜在载体。外泌体作为功能性小RNA和蛋白质的天然载体也引起了药物递送领域的极大兴趣，因为它可以利用这些囊泡治疗性递送各种核糖核酸分子、肽和合成药物。

虽然系统递送的外泌体主要在肝脏、肾脏和脾脏中积累，但通过在外泌体的外表面上展示特定的靶向分子。例如，识别靶抗原的肽或抗体片段，可以获得靶向外泌体；通过在细胞分泌囊泡上展示糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的纳米抗体，可以使细胞分泌囊泡显示多种蛋白，包括抗体、荧光蛋白和信号分子。自然分泌的外泌体分离纯化直接作为药物的潜力有限，但是，将自然的外泌体分泌所需组分掺入合成脂质体或纳米颗粒中，并且使用可控程序组装后的工程化外泌体模拟物在药学上拥有更大的应用潜力。

外泌体作为疾病诊断标志物的潜在应用依赖于基于外泌体的药物递送系统的技术突破，要将其用于临床治疗，外泌体的大规模工业化生产还面临很大的挑战。首先，对外泌体的具体合成机制、功能了解并不是非常详细。其次，现在缺乏经济有效的外泌体分离技术。然而，虽然当前外泌体生物学仍然不成熟，但越来越多的兴趣和资金投入必将加速外泌体基础研究进展和临床转化。